Phân tích axit amin là gì? Các bài báo nghiên cứu khoa học

Định nghĩa phân tích axit amin

Phân tích axit amin là kỹ thuật định tính và định lượng các axit amin có trong mẫu sinh học, nhằm xác định hàm lượng, thành phần hoặc dạng tồn tại của axit amin. Phương pháp này được áp dụng trong các lĩnh vực như nghiên cứu protein, xác định giá trị dinh dưỡng của thực phẩm, theo dõi rối loạn chuyển hóa, kiểm định dược phẩm và sinh học phân tử.

Axit amin là đơn vị cơ bản cấu tạo nên protein, đóng vai trò thiết yếu trong hoạt động sống và cấu trúc của tế bào. Phân tích chính xác các axit amin đòi hỏi sự kết hợp của quá trình chuẩn bị mẫu, tách chiết, dẫn xuất hóa học và đo tín hiệu bằng các kỹ thuật sắc ký hoặc khối phổ.

Các thông số đầu ra phổ biến:

• Hàm lượng từng loại axit amin (µmol/g, nmol/mL)
• Tỷ lệ mol giữa các axit amin thiết yếu và không thiết yếu
• Biểu đồ hồ sơ axit amin (amino acid profile)

Phân loại phương pháp phân tích axit amin

Có nhiều phương pháp phân tích axit amin khác nhau, mỗi phương pháp phù hợp với mục tiêu phân tích và loại mẫu cụ thể. Các phương pháp này có thể phân loại theo nguyên lý tách, phương thức phát hiện hoặc mức độ tự động hóa. Ba kỹ thuật phổ biến nhất hiện nay gồm:

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
• Khối phổ (MS/MS)
• Điện di mao quản (CE)

Sắc ký lớp mỏng (TLC) từng là phương pháp truyền thống, nhưng ngày nay ít được sử dụng do độ chính xác và độ lặp lại thấp. Trong khi đó, HPLC dẫn xuất huỳnh quang được coi là tiêu chuẩn vàng nhờ độ nhạy cao, định lượng chính xác và thích hợp với cả mẫu tự do và mẫu sau thủy phân protein.

Bảng dưới đây so sánh một số đặc điểm giữa các phương pháp chính:

Phương pháp	Độ nhạy	Định lượng	Ứng dụng
HPLC + dẫn xuất OPA/FMOC	Cao	Chính xác	Thực phẩm, y sinh, sinh học phân tử
MS/MS	Rất cao	Định tính và định lượng	Chẩn đoán rối loạn chuyển hóa, xác định axit amin hiếm
CE	Trung bình–cao	Hạn chế	Mẫu nhỏ, tốc độ cao

Tiền xử lý mẫu và thủy phân protein

Trước khi phân tích axit amin trong protein, cần thực hiện thủy phân protein để giải phóng các axit amin liên kết. Thủy phân axit là phương pháp phổ biến nhất, sử dụng HCl 6M ở nhiệt độ 110°C trong 22–24 giờ trong môi trường không oxy để hạn chế oxy hóa các axit amin nhạy cảm.

Tuy nhiên, một số axit amin dễ bị phân hủy như tryptophan, cysteine và methionine yêu cầu thủy phân riêng biệt hoặc sử dụng enzyme protease như pronase, pepsin hoặc trypsin. Ngoài ra, dẫn xuất hóa học có thể được thực hiện trước hoặc sau thủy phân tùy vào kỹ thuật sử dụng.

Phản ứng tổng quát: $\text{Protein} + \text{H}_2\text{O} \xrightarrow{\text{HCl, 110^\circ C}} \sum \text{Axit amin}$

Phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là kỹ thuật tách dựa trên sự phân bố giữa pha động và pha tĩnh, kết hợp với detector UV hoặc huỳnh quang để phát hiện axit amin sau dẫn xuất hóa học. Các tác nhân dẫn xuất thông dụng gồm:

• OPA (ortho-phthalaldehyde) – tạo dẫn xuất huỳnh quang với nhóm amin sơ cấp
• FMOC-Cl – dùng cho axit amin có nhóm amin thứ cấp

Hệ thống HPLC bao gồm: bơm cao áp, cột sắc ký C18, hệ thống tự động tiêm mẫu, detector (UV, FLD hoặc DAD), và phần mềm xử lý tín hiệu. Thời gian phân tích thông thường: 30–90 phút/mẫu. Để chuẩn hóa, người phân tích thường sử dụng nội chuẩn như norvaline hoặc α-aminobutyric acid.

Một số biến thể hiện đại như UHPLC (ultra-high performance LC) cho phép tăng tốc độ phân tích, giảm thể tích mẫu và cải thiện độ phân giải giữa các axit amin đồng phân.

Phân tích bằng khối phổ (MS) và kỹ thuật kết hợp

Khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là kỹ thuật phân tích cấu trúc và khối lượng phân tử chính xác, được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu axit amin nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Khi kết hợp với HPLC hoặc CE, MS giúp xác định và định lượng cả axit amin tự do và các sản phẩm chuyển hóa hiếm gặp trong sinh lý học và lâm sàng.

Các hệ thống MS phổ biến gồm:

• ESI-MS: ion hóa phun điện, phù hợp với phân tử phân cực, ứng dụng tốt cho mẫu sinh học
• MALDI-TOF-MS: phù hợp với peptide và protein nhỏ, thường dùng trong xác định trình tự
• Q-TOF-MS: kết hợp độ chính xác cao và phân tích định lượng trong thời gian thực

Ưu điểm nổi bật của MS là khả năng phát hiện axit amin bị biến đổi sau dịch mã (post-translational modifications), đồng phân lập thể và các chất trung gian trao đổi chất quan trọng như homocysteine, ornithine hoặc citrulline.

Ứng dụng trong nghiên cứu và chẩn đoán y học

Phân tích axit amin đóng vai trò quan trọng trong sinh học y học, đặc biệt trong việc phát hiện và theo dõi các bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh (inborn errors of metabolism – IEM). Ví dụ điển hình là bệnh phenylketon niệu (PKU), trong đó phân tích axit amin máu khô (DBS) giúp phát hiện tăng phenylalanine – một chỉ dấu quan trọng cho chẩn đoán sớm.

Ngoài ra, phương pháp này còn được dùng để theo dõi:

• Bệnh gan – tăng tyrosine, methionine
• Suy thận – tích lũy axit amin thơm
• Ung thư – thay đổi hồ sơ axit amin ngoại bào và nội bào

Hệ thống MS-MS (tandem mass spectrometry) được sử dụng trong chương trình tầm soát sơ sinh tại nhiều quốc gia để phát hiện hàng chục rối loạn chuyển hóa chỉ từ vài microlit máu.

Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm, phân tích axit amin được sử dụng để đánh giá giá trị dinh dưỡng và xác định sự có mặt của protein lạ hoặc bị thay thế. Hồ sơ axit amin của protein thực phẩm giúp xác định các chỉ số dinh dưỡng như:

• PDCAAS (Protein Digestibility Corrected Amino Acid Score)
• BV (Biological Value)
• PER (Protein Efficiency Ratio)

Một ví dụ là so sánh thành phần axit amin giữa đậu nành, whey và casein để xác định chất lượng protein đối với trẻ nhỏ hoặc người luyện tập thể hình.

Trong dược phẩm, kỹ thuật này hỗ trợ:

• Kiểm định độ tinh khiết và thành phần của peptide tổng hợp
• Định lượng axit amin trong chế phẩm tiêm tĩnh mạch
• Phân tích hồ sơ axit amin trong kháng thể đơn dòng hoặc vaccine

Giới hạn kỹ thuật và xử lý sai số

Phân tích axit amin không phải không có hạn chế. Một số axit amin như tryptophan, cysteine hoặc asparagine dễ bị phân hủy hoặc biến đổi trong quá trình thủy phân, dẫn đến sai số định lượng. Ngoài ra, nhiễu tín hiệu từ nền mẫu giàu muối hoặc lipid có thể ảnh hưởng đến độ chính xác của MS.

Một số biện pháp xử lý sai số gồm:

• Sử dụng nội chuẩn đồng vị (isotopic internal standards)
• Chuẩn hóa quy trình dẫn xuất và thời gian thủy phân
• Kiểm tra hồi quy tuyến tính của đường chuẩn
• Sử dụng phần mềm phân tích phổ chuyên biệt như Xcalibur, Analyst hoặc MassLynx

Bên cạnh đó, các tiêu chuẩn quốc tế như AOAC, USP hoặc ISO 13903 quy định rõ quy trình phân tích axit amin trong thực phẩm và dược phẩm nhằm đảm bảo độ tin cậy và khả năng tái lập.

Xu hướng phát triển và tự động hóa

Các hệ thống phân tích axit amin hiện đại hướng đến tự động hóa và tích hợp nhiều chức năng trong cùng một thiết bị. Máy phân tích tự động như Hitachi L-8900 hay Biochrom 30+ cho phép từ xử lý mẫu đến phân tích và xuất dữ liệu chỉ trong 1–2 giờ/mẫu với độ lặp lại cao.

Xu hướng tương lai bao gồm:

• Tích hợp công nghệ microfluidics để giảm lượng mẫu và thuốc thử
• Sử dụng AI để phát hiện mẫu bất thường và phân tích dữ liệu phổ
• Kết hợp với sinh học hệ thống (systems biology) để giải thích biến động axit amin trong mạng lưới trao đổi chất toàn cơ thể

Các công nghệ mới hứa hẹn tăng tốc phân tích, giảm chi phí và mở rộng khả năng phát hiện các chỉ dấu bệnh tiềm ẩn.

Tài liệu tham khảo

1. Amino acid analysis: methods and applications (NCBI)
2. Thermo Fisher Scientific – Amino Acid Analysis
3. Agilent Technologies – Amino Acid Analysis Solutions
4. Sigma-Aldrich – Amino Acid Analysis Guide
5. Rosenberg, I. M. (2005). Protein Analysis and Purification: Benchtop Techniques. Springer.